簡述DNA甲基化檢測

    DNA甲基化是哺乳類動物一個重要的基因外遺傳信號。有研究表明,DNA甲基化與大多數(shù)腫瘤的發(fā)生相關,抑癌基因啟動子CpG島的高度甲基化可引起抑癌基因表達沉默，細胞出現(xiàn)無節(jié)制生長,導致腫瘤的發(fā)生。目前，基因的甲基化研究主要結合亞硫酸氫鈉處理和PCR技術，分為甲基化特異性PCR（Methylation specific PCR,MSP）和硫化測序PCR（Bisulfite sequencing PCR, BSP）。 

 

甲基化特異性的PCR（MSP）原理：

     雙鏈DNA變性解鏈后，在HSO3-作用下發(fā)生C→U轉化，C若已有甲基化則無此改變；甲基化修飾只發(fā)生于5′→3′方向C-G相聯(lián)結構的C上，因此在HSO3-作用后，DNA CpG島若無甲基化，則序列中的改變?yōu)镃→U，CG→UG，若有甲基化則為C→U，CG→CG，用不同的引物做PCR，即可檢測出這種差異，從而確定基因有無CpG島甲基化。從理論上說，DNA發(fā)生甲基化的MSP產(chǎn)物的序列與原序列比較，變化為C→T，CG→CG，相應其互補鏈的改變?yōu)镚→A，CG→CG。然后設計針對甲基化和非甲基化序列的引物并進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增，zui后通過瓊脂糖凝膠電泳分析，確定與引物互補的DNA序列的甲基化狀態(tài)。MSP法靈敏度較高，應用范圍廣。

 

硫化測序PCR（BSP）原理：

    結合重亞硫酸鹽的測序法是一種靈敏的能直接檢測分析基因組DNA甲基化模式的方法。重亞硫酸鹽處理后，用針對改變后的DNA序列設計特異性引物并進行聚合酶鏈式反應（PCR）。 PCR產(chǎn)物中原先非甲基化的胞嘧啶位點被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位點保持不變。PCR產(chǎn)物克隆后進行測序。通過這個方法能得到特定位點在各個基因組DNA分子中的甲基化狀態(tài)。

 

甲基化服務流程：

1）   根據(jù)目的基因啟動子序列設計相應引物；
2）   基因組DNA的提取和定量；
3）   亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA；
4）   修飾后DNA純化回收；
5）   a、結合實時定量PCR的qMSP；
        b、BSP，對PCR產(chǎn)物進行測序并與未經(jīng)處理的序列比較；
6）   數(shù)據(jù)處理；
7）   向客戶提交數(shù)據(jù)分析結果與實驗報告。

 

樣品要求：

    盡可能新鮮和足量的組織（≥50mg）、細胞樣品（≥106）或全血（≥300μl），或直接提供純化好的DNA（≥5μg/樣品）。

 

基因甲基化檢測

    甲基化是在DNA甲基轉移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine, SAM）提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶環(huán)的五號碳原子上加上甲基的共價修飾過程.

    DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式，它不改變DNA的一級結構，卻在細胞的發(fā)育、基因的表達、及基因組的穩(wěn)定性中起著重要的作用。

    CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象，而啟動子CpG 島的高甲基化是除突變和缺失外腫瘤中抑癌基因失活的第三種機制。

    因此，基因啟動子甲基化檢測在臨床診斷（如甲基化檢測與低劑量CT相結合）、藥物敏感性檢測等方面具有很高的應用價值。

    目前甲基化特異性PCR（Methylmion Specific PCR，MSP）及其改進方法是檢測基因甲基化的經(jīng)典方法．MSP法的原理是首先用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶都被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則不變。然后設計針對甲基化和非甲基化序列的引物并進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增，zui后通過瓊脂糖凝膠電泳分析，確定與引物互補的DNA序列的甲基化狀態(tài)。