miRNA定量檢測(cè)解讀

 　　miRNA定量檢測(cè)就是在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，通過(guò)熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。由于miRNA定量檢測(cè)的眾多優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在已經(jīng)是生命科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù)，并成為基因表達(dá)差異和文章發(fā)表*的部分。miRNA定量檢測(cè)輸出的數(shù)據(jù)不同于常規(guī)PCR電泳檢測(cè)，很多沒(méi)有做過(guò)miRNA定量檢測(cè)的研究者常常感到高深莫測(cè)，不知從何入手；甚至一些做過(guò)一些實(shí)驗(yàn)的研究者也會(huì)對(duì)數(shù)據(jù)處理分析感到迷惑。很多時(shí)候，盡管知曉qPCR的原理和基本操作，仍然浪費(fèi)時(shí)間和精力，而得不到好的結(jié)果或?qū)Υ罅康臄?shù)據(jù)不知所措。
　　上?；偕锟萍加邢薰镜膍iRNA定量檢測(cè)技術(shù)服務(wù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案（相對(duì)定量或定量；SYBR Green I或Taqman探針?lè)椒ǎ?，?按照符合標(biāo)準(zhǔn)（MIQE）的miRNA定量檢測(cè)試劑完成實(shí)驗(yàn)，提供符合文章發(fā)表的客觀事實(shí)實(shí)驗(yàn)報(bào)告和原始數(shù)據(jù)。
　　miRNA定量檢測(cè)是 19~28 nt 的調(diào)控RNA分子，主要包括微 RNA（micro RNA，miRNA）和小干涉RNA(short interfering RNA，siRNA)兩類(lèi)，其中的miRNAs成為繼 siRNAs之后新的研究熱點(diǎn)之一，名列2002年和2003年美國(guó)《科學(xué)》雜志評(píng)出的年度科學(xué)成就。
　　miRNA定量檢測(cè)中的miRNA是長(zhǎng)片段RNA序列的一部分，同siRNAs一樣是比較短小的單鏈小分子RNA，一般來(lái)源于染色體的非編碼區(qū)域，由大約70 nt大小的可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體加工而來(lái)，miRNA定量檢測(cè)通過(guò)與其目標(biāo)mRNA分子的3 端非編碼區(qū)域（3-untranslated region，3 UTR）互補(bǔ)導(dǎo)致該mRNA分子的翻譯受到抑制。
　　要了解miRNA在基因調(diào)控中扮演的角色，很關(guān)鍵的一個(gè)方法就是迅速、準(zhǔn)確地定量檢測(cè)miRNA基因的表達(dá)。因此，miRNA定量檢測(cè)表達(dá)水平的檢測(cè)也成為了科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。但是由于小分子RNA是一類(lèi)很小的分子，部分小分子RNA表達(dá)水平可能很低，因而需要極為靈敏而定量的分析工具。miRNA定量檢測(cè)常用的檢測(cè)方法有：
　　1.  Northern blotting
　　2.  核糖核酸酶保護(hù)分析以及基于此方法的液相雜交。
　　3.  RT-PCR也被用來(lái)miRNA定量檢測(cè)前體的表達(dá)水平， 其他基于PCR技術(shù)檢測(cè)miRNA的方法有引物延伸法，就是在引物的5 末端加一個(gè)特異標(biāo)記，可以定量測(cè)定低豐度的RNA含量；原位雜交技術(shù)（CISH,FISH）可以方便的檢測(cè)miRNA的時(shí)空表達(dá)的差異。
　　4.  芯片(microarrays)技術(shù)[46,47]是一種較快的研究miRNA表達(dá)的方法。
　　miRNA定量檢測(cè)方法克服了由于miRNA分子太短（~22 nt）帶來(lái)的定量zui大難題而引入靶向特異性的反轉(zhuǎn)錄引物，該RT引物可以與成熟miRNA結(jié)合，形成反轉(zhuǎn)錄引物/成熟miRNA復(fù)合物，并在miRNA的5’末端延伸。這樣就得到一個(gè)較長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增因子，為進(jìn)一步做實(shí)時(shí)定量PCR提供了符合要求的摸板。