關(guān)于蛋白質(zhì)提取與純化

一、 蛋白質(zhì)的提取

    微生物生產(chǎn)的蛋白質(zhì)或酶有來(lái)自胞內(nèi)、來(lái)自細(xì)胞周質(zhì)或被分泌到培養(yǎng)介質(zhì)中。對(duì)胞外酶而言，當(dāng)zui后產(chǎn)品是用于工業(yè)用途而不是需要太高純度時(shí)，純化工藝比較簡(jiǎn)單。許多酶是以更為復(fù)雜的胞內(nèi)混合物的形式存在，這對(duì)蛋白質(zhì)純化研究人員提出更多的挑戰(zhàn)。

    正常來(lái)說(shuō)，大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。

    （1）水溶液提取法：稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)zui常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時(shí)需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時(shí)間。但另一方面，溫度升高會(huì)使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)一般采用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。


A、pH值
    蛋白質(zhì)，酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時(shí)，應(yīng)防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來(lái)說(shuō)，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。


B、鹽濃度
    稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解，稱為鹽溶作用。同時(shí)稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn)，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。

 

   （2）有機(jī)溶劑提取法：一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強(qiáng)的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對(duì)提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別*，一是因?yàn)槎〈加H脂性強(qiáng)，特別是溶解磷脂的能力強(qiáng)；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)（度為10%，40度為6.6%）不會(huì)引起酶的變性失活。

 另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動(dòng)植物及微生物材料。

 

二、 蛋白質(zhì)的分離純化

親和層析法： 

    親和層析的原理與*的抗原一抗體、激素一受體和酶一底物等特異性反應(yīng)的機(jī)理相類似，每對(duì)反應(yīng)物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應(yīng)中，特異的廢物（S'）才能和一定的酶（E）結(jié)合，產(chǎn)生復(fù)合物（E－S'）一樣。在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，并產(chǎn)生復(fù)合物。而親和層析與酶一底物反應(yīng)不同的是，前者進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，配體（類似底物）是固相存在；后者進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，底物呈液相存在。實(shí)質(zhì)上親和層析是把具有識(shí)別能力的配體L（對(duì)酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等）以共價(jià)鍵的方式固化到含有活化基團(tuán)的基質(zhì)M（如活化瓊脂糖等）上，制成親和吸附劑M－L，或者叫做固相載體。而固化后的配體仍保持束縛特異物質(zhì)的能力。因此，當(dāng)把圍相載體裝人小層析柱（幾毫升到幾十毫升床體積）后，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時(shí)樣品中對(duì)配體有親和力的物質(zhì)S就可借助靜電引力、范德瓦爾力，以及結(jié)構(gòu)互補(bǔ)效應(yīng)等作用吸附到固相載體上，而無(wú)親和力或非特異吸附的物質(zhì)則被起始緩沖液洗滌出來(lái)，并形成了*個(gè)層析峰。

    然后，恰當(dāng)?shù)馗淖兤鹗季彌_ 液的PH值、或增加離子強(qiáng)度、或加人抑③劑等因子，即可把物質(zhì)S從固相載體上解離下來(lái)，并形成了第M個(gè)層析峰（見圖6－2）。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質(zhì)滿意地分離開。如果樣品液中存在兩個(gè)以上的物質(zhì)與固相載體具有親和力（其大小有差異）時(shí)，采用選擇性緩沖液進(jìn)行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經(jīng)再生處理后，可以重復(fù)使用。

一）原理

    親和層析是一種吸附層析，抗原（或抗體）和相應(yīng)的抗體（或抗原）發(fā)生特異性結(jié)合，而這種結(jié)合在一定的條件下又是可逆的。所以將抗原（或抗體）固相化后，就可以使存在液相中的相應(yīng)抗體（或抗原）選擇性地結(jié)合在固相載體上，借以與液相中的其他蛋白質(zhì)分開，達(dá)到分離提純的目的。親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái)，而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體（Ligand）的分子能特異而非共價(jià)地結(jié)合。其基本原理：蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在，每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學(xué)中的重要的一部分，至今還沒的單獨(dú)或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來(lái)，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。

    此法具有、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

二）載體的基本要求和選擇

理想的載體應(yīng)具有下列基本條件：①不溶于水，但高度親水；②惰性物質(zhì)，非特異性吸附少；③具有相當(dāng)量的化學(xué)基團(tuán)可供活化；④理化性質(zhì)穩(wěn)定；⑤機(jī)械性能好，具有一定的顆粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使大分子能自由通過；⑦能抵抗微生物和醇的作用。

    可以做為固相載體的有皂土、玻璃微球、石英微球、羥磷酸鈣、氧化鋁、聚丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素和瓊脂糖。在這些載體中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特異性吸附。纖維素的非特異性吸附強(qiáng)。聚丙稀酰胺凝膠是目前的優(yōu)良載體。

    瓊脂糖凝膠的優(yōu)點(diǎn)是親水性強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定，不受細(xì)菌和酶的作用，具有疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在緩沖液離子濃度大于0.05Mol/L時(shí)，對(duì)蛋白質(zhì)幾乎沒有非特異性吸附。瓊脂糖凝膠極易被溴化氫活化，活化后性質(zhì)穩(wěn)定，能經(jīng)受層析的各種條件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl處理2h-3h及蛋白質(zhì)變性劑7Mol/L尿素或6Mol/L鹽酸胍處理，不引起性質(zhì)改變，故易于再生和反復(fù)使用。

    瓊脂糖凝膠微球的商品名為Sepharose，含糖濃度為2%、4%、6%時(shí)分別稱為2B、4B、6B。因?yàn)镾epharose 4B的結(jié)構(gòu)比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B應(yīng)用zui廣。

三）試劑與配制

    1．Sepharose 4B

    2．CNBr

    3．抗原或抗體

    4．1Mol/L NaHCO3  取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。

    5．0.1Mol/L NaHCO3

    6．2Mol/L NaOH

    7．0.01Mol/L pH7.4 PBS

       0.2Mol/L Na2HPO4   38.0ml

       0.2Mol/L Na2HPO4  162.0ml

       NaCl      32.76g

    加水至4 000ml。

    8．0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl緩沖液  甘氨酸15.01g加水至1 000ml，取此液，加0.2Mol/L HCl 84ml加水166ml共500ml。

    9．7Mol/L尿素

    10．0.2Mol/L NaHCO3,（含0.1Mol/L NaCI）

       1Mol/L NaHCO3  100.00ml

              NaCl     2.93g

       加水至500.00ml。

四）實(shí)驗(yàn)方法

    1．瓊脂糖活化

    ⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗滌，立即轉(zhuǎn)入100ml燒杯中，冰浴置于磁力攪拌器上。

    ⑵ 在通風(fēng)櫥內(nèi)稱取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入瓊脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反應(yīng)10min。在1min~2min迅速調(diào)整pH為8.0～11.0維持10min。

    ⑶ 將活化的瓊脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。

2．偶聯(lián)蛋白  20ml 4B液體相當(dāng)于一半的固相載體。

⑴ 事先將需偶聯(lián)的抗原（或抗體）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析數(shù)小時(shí)（一般偶聯(lián)量為10~30mg/g載體）。

⑵ 將活化的瓊脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min內(nèi)，從抽洗到偶聯(lián)），4℃緩慢攪拌一晚，使蛋白與活化的瓊脂結(jié)合。

3．裝柱

    ⑴ 選柱：不宜過大，一般以1.5×15cm的層析柱可裝偶聯(lián)蛋白的瓊脂糖約30ml。

    ⑵ 裝柱：將已與蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖裝入層析柱內(nèi)，擰緊下口夾，讓其下沉，數(shù)分鐘后松開下口夾，使溶液約以1ml/min的速度流出。

    ⑶ 洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗滌至洗出液的OD280＜0.02為止。

收集全部的洗脫液，測(cè)得的OD280值×洗脫液的總ml數(shù)即為未偶聯(lián)蛋白的含量，由此可計(jì)算偶聯(lián)率。

 4．吸附與解吸附

    ⑴按床體積1/10加樣，濃度為1％～2%，緩慢加入待純化的抗體（或抗原），用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脫，流速為1ml/min，至洗出液OD280＜0.02為止。

    ⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸－HCl緩沖液，流速1ml/min，收集解吸附下來(lái)的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白變性。

5．以兩倍體積的7Mol/L尿素洗滌，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理鹽水洗滌，平衡后，可繼續(xù)使用。保存可加入0.02%Na N3于4℃保存。防止冷凍和干裂。

6．結(jié)果判定

    ⑴ 對(duì)解吸附下來(lái)的蛋白以圓盤電泳或雙相瓊脂糖電泳進(jìn)行純度鑒定。

    ⑵ 將純度好的各管洗脫液合并，以生理鹽水透析，然后濃縮或凍干保存。

       蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學(xué)和生物等各方面知識(shí)，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別，把它們分配到可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中，如鹽析，有機(jī)溶劑提取，層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場(chǎng)的作用使各組分分配于來(lái)同區(qū)域而達(dá)到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應(yīng)用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、鹼、高溫，劇烈機(jī)械作用而導(dǎo)致所提物質(zhì)生物活性的喪失。