TA克?。═A-cloning）

     TA克隆（TA-cloning）是利用Taq聚合酶的特性將PCR產(chǎn)物克隆的方法，又稱為T-載體克隆。

     Taq DNA聚合酶在四種dNTP存在下可以向非特性的PCR產(chǎn)物的3’末端特異性的添加一個A。這也成為Taq酶催化的PCR產(chǎn)物不能的連接至平末端載體的主要原因。相反地，如果此時有一個線性的帶有粘性T末端的載體DNA（T載體），那么帶有A粘性末端的PCR產(chǎn)物就可以的插入載體DNA中。這種方法被稱為TA克隆。

 

實驗材料：

Invitrogen公司提供的TOPO 快速TA 克隆試劑盒。我們采用pCR®II-TOPO®體系。

內(nèi)含TOPO TACloning® reagents （Box 1） 和 One Shot® Chemically Competent cells （Box 2）.

TOPO 反應(yīng)鹽溶液：200 mM NaCl,10 mM MgCl2。

 

實驗步驟：

 

總體步驟：

PCR 反應(yīng)

進行TOPO反應(yīng)，連接PCR產(chǎn)物與TOPO載體

用連接好的TOPO克隆轉(zhuǎn)化TOPO感受態(tài)細胞

藍白斑篩選

 

細節(jié)：

1、PCR 反應(yīng)

按正常步驟用Taq聚合酶進行PCR反應(yīng)循環(huán)。

 

2、進行TOPO反應(yīng)，連接PCR產(chǎn)物與TOPO載體

在反應(yīng)體系中加入如下反應(yīng)物：

新鮮的PCR產(chǎn)物1ul

TOPO反應(yīng)鹽溶液 1ul

無菌水 4ul

TOPO® vector 1ul

共 6ul

輕輕混合以上反應(yīng)物，在室溫（22oC-23oC）溫育5分鐘。

將以上反應(yīng)物置于冰上，進行轉(zhuǎn)化

 

3、用連接好的TOPO克隆轉(zhuǎn)化TOPO感受態(tài)細胞

向試劑盒提供的 One Shot® Chemically Competent E. coli中加入2ul以上反應(yīng)液，輕輕混勻。在冰上進行轉(zhuǎn)染10分鐘。

在42oC下熱刺激細胞30秒，然后馬上轉(zhuǎn)移至冰上。

向體系中加入250ul 室溫下的SOC 培養(yǎng)液。

水平離心轉(zhuǎn)化管（200rpm, 37oC）1小時。

用10~50ul 轉(zhuǎn)化液向預(yù)熱的培養(yǎng)基鋪板。

 

4、藍白斑篩選

取出10個白色或淺藍色的菌落在含有50ug/ml卡那霉素或氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

提純質(zhì)粒，進行鑒定。

 

 

其中的T載體可以用以下三種方法構(gòu)建：

Ø 一種載體可以用限制性內(nèi)切酶如XcmI, HphI, 與MobII 酶切消解產(chǎn)生，3‘末端未配對的T。

Ø 應(yīng)用末端轉(zhuǎn)移酶與雙脫氧TTP加入一個突出的T殘基到線形化載體的3’末端。

Ø 應(yīng)用不依賴末端的Taq DNA聚合酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性在線形化載體的3‘末端出的羥基基團上催化連接上一個T堿基。

 

    但是并非所有可用于PCR的耐熱DNA聚合酶都具有非模版依賴的A添加能力。例如常用于高精度PCR反應(yīng)的Pfu 聚合酶只能產(chǎn)生平末端，因而不能夠用于TA克隆。

 

     目前，T載體可以從許多供應(yīng)商那里購買得到克隆化的試劑盒，如pCR-Script[SK+]（from Statagene 公司），PCRII的TA克隆試劑盒（from Invitrogen 公司），PGEM-T （from Promega 公司）等等。

 

    以下以PCRII的TA克隆試劑盒（from Invitrogen 公司）為例講述TA cloning 的過程：

    從牛痘病毒（Vaccinia）中提取的DNA拓撲異構(gòu)酶1可以識別5’-CCCTT序列，并連接5’-CCCTT和外源DNA（Shuman, 1991，1994），因而可用于TA cloning。

 

參考文獻：

1. Joseph Sambrook，David W Russell. Molecular cloning（3rd edition）

2. Shuman, S. （1991）.  Recombination Mediated by Vaccinia Virus DNA Topoisomerase I in Escherichia coli is Sequence Specific. Proc. Natl. Acad. Sci. 

3. Holton TA, Graham MW.  A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors.  Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11;19（5）:1156

4. Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collins FS.  Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11;19（5）:1154.

5. Borovkov AY, Rivkin MI.  XcmI-containing vector for direct cloning of PCR products. Biotechniques. 1997 May;22（5）:812-4. 

6. Kovalic D, Kwak JH, Weisblum B.  General method for direct cloning of DNA fragments generated by the polymerase chain reaction.  Nucleic Acids Res. 1991 Aug 25;19（16）:4560. 

7. Hengen PN.  Fidelity of DNA polymerases for PCR. Trends Biochem Sci. 1995 Aug;20（8）:324-5. 

8. Leal, J.F.M.; López-Barea, J.; Dorado, G.  T-vector cloning and high performance PCR with SuperTth from Thermus thermophilus  Genetic Analysis: Biomolecular Engineering Volume: 12, Issue: 2, October, 1995, pp. 119-121  

9. Hoover C, 1998 July 8. Invitrogen web catalog.  Accessed 1999 Feb 14.