熒光定量PCR的原理、方法及結(jié)果分析
自K. Mullis發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)以來,PCR技術(shù)很快成為科研、臨床診斷的熱點技術(shù)。RT-PCR(實時熒光定量PCR技術(shù))就是在PCR的基礎(chǔ)上加入熒光基團(tuán),通過熒光信號的變化的實時監(jiān)測PCR的反應(yīng)過程,通過對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。目前,實時熒光定量 PCR 已成為不同樣品間進(jìn)行基因表達(dá)水平定量差異比較的權(quán)威性方法。在過去十幾年中,該方法迅速流行,涉及科學(xué)的多個領(lǐng)域,包括農(nóng)業(yè)、環(huán)境、工業(yè)和醫(yī)學(xué)研究。
目前,qPCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疾病的早期診斷、遺傳病的早期診斷、藥物研究、腫瘤的診斷與研究、食品病原微生物的檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測、動物疫病檢測等,除此之外,還包括:
● 基因擴(kuò)增
● 擴(kuò)增特異性分析
● 基因定量分析
● 基因檢測
● 基因分型
● SNP分析
● RFLP多態(tài)性分析
● 單/多基因表達(dá)研究
● 高通量基因表達(dá)譜研究
……
?。?)染料法
熒光染料可與雙鏈DNA結(jié)合,每個循環(huán)的延伸階段,染料摻入雙鏈DNA中,其熒光信號強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。同時,其缺點也在于其非特異性。當(dāng)PCR反應(yīng)中有引物二聚體或者非特異性擴(kuò)增時,該染料也可以和這些非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合,發(fā)出熒光,從而干擾對特異性產(chǎn)物的準(zhǔn)確定量。
常用的染料為SYBR Green I,各公司針對熒光信號強(qiáng)度、抑制作用等進(jìn)行改進(jìn),也推出了很多新的染料供大家選擇。
Promega采用新型熒光染料BRYT Green? Dye,對qPCR反應(yīng)沒有抑制作用,與雙鏈DNA結(jié)合后熒光信號更強(qiáng).
?。?)探針法
在PCR擴(kuò)增時加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸:5’端標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán),3’端標(biāo)記一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時,報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時,Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。
?。?)熒光定量
一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化;在平臺期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級增加,PCR終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,無法計算起始模板拷貝數(shù)。因此只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段,PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,故選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了幾個重要的概念:擴(kuò)增曲線、熒光閾值、CT值。
注:
橫坐標(biāo):代表擴(kuò)增循環(huán)數(shù);
縱坐標(biāo):代表熒光強(qiáng)度,每個循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號收集。
熒光閾值(Threshold)
在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值,它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上,但一般熒光閾值的設(shè)置是PCR反應(yīng)前3-15個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。(如下圖)
每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),縱坐標(biāo)代表Ct值。因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。同時,對于熒光PCR實驗來說,CT值也是判讀樣品陰陽性的重要指標(biāo)。(如下圖)
實驗室應(yīng)用
PCR檢測方法在臨床醫(yī)學(xué)及實驗室檢驗中最有價值的應(yīng)用領(lǐng)域就是對感染性疾病的診斷。理論上,只要樣本有一個病原體存在,PCR方法就可以檢測到。該方法對病原體的檢測解決了免疫學(xué)檢測的“窗口期”問題,常用于疾病的早期診斷,可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。
大量的熒光定量PCR研究資料表明,病原體數(shù)量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有相關(guān)性。因此,通過熒光定量PCR方法得到的檢測結(jié)果,一定程度上可以準(zhǔn)確反映疾病感染的情況。
除此之外,也可以見于腫瘤分子機(jī)制、遺傳病篩查、樣本成分鑒定等多方面的實際應(yīng)用中。